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[交流] [分子医学] 目的基因拷贝数对酵母系统表达外源蛋白效率的影响

[交流] [分子医学] 目的基因拷贝数对酵母系统表达外源蛋白效率的影响

交流

原创与否 -
酵母是一种单细胞低等真核生物,培养条件普通,生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时可以大规模生产,有效降低了生产成本。酵母表达系统的载体一般是一种穿梭质粒,属于大肠杆菌-酵母穿梭载体,即在大肠杆菌中筛选和扩增,在酵母中表达。在应用时需要考虑不同大肠杆菌-酵母穿梭载体的用途不同,在酵母中的复制方式和所携带目的基因的表达方式也不同。其中目的基因的拷贝数是影响酵母表达系统表达外源蛋白效率的一个重要因素。

通常目的基因拷贝数越高,表达效率越高,适当增加目的基因整合到酵母染色体上的拷贝数可以有效提高外源基因表达量。如人肿瘤坏死因子(TNF)、破伤风毒素片段C和鼠表皮生长因子(EGF)等,目前许多研究者把提高拷贝数作为提高表达的重要方面。外源基因在酵母表达系统中的拷贝数影响外源基因的表达水平,目前常用的提高外源基因整合拷贝数的方法有:(1)通过不同的转化方法提高整合拷贝数;(2)在体外载体上多次插入目的基因片断;(3)将载体中的基因两端连上来自宿主或其他非必需高重复的基因片断,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的。
如有研究者体外构建戊型肝炎病毒(HEV) ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,以提高HEVORF2128-660在毕赤酵母中的表达水平[1]。研究者采用PCR技术扩增目的基因ORF2128-660(E),然后将ORF2128-660(E)同义点突变为ORF2128-660,构建重组表达质粒ORF2128-660/pAO815(单拷贝),BamH Ⅰ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-ORF2128-660)插入去磷酸化的质粒ORF2128-660/pAO815,得到2(AOX-ORF2128-660)/pAO815(2拷贝)质粒等等。最后该研究者成功构建了HEVORF2128-660多拷贝表达质粒,提高了其在毕赤酵母中的表达水平。

酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具,拥有转录后加工修饰功能, 适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。美迪西科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台,提供优质的重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。

不过整合过多的外源基因拷贝数将导致重组DNA的不稳定,有时会有负效应,也有研究发现有的多拷贝基因的目的蛋白表达量与其拷贝数并不呈线性正相关。有研究者对恶性疟原虫pfs25的多拷贝基因重组菌株在毕赤酵母中进行表达分析,研究基因拷贝数对Pfs25蛋白表达量的影响,拟采用增加pfs25 重组蛋白在毕赤酵母表达系统中的分泌表达[2]。研究者构建重组质粒pAO815 - αpfs25,利用BgllⅡ- BamHI同尾酶的特点,将基因表达框AOX1 - αpf25 - AOX1 (TT)插入到单拷贝表达质粒,依次重复,构建多拷贝重组质粒pAO815 -(αpfs25)n,线性化后电转化毕赤酵母GS115,用MD平板筛选并进行表达分析。研究者成功得到了pfs25基因的多拷贝表达重组菌株,经分析,多拷贝pfs25基因的目的蛋白表达量与其拷贝数并不呈线性正相关。

虽然目的基因拷贝数是影响酵母表达系统表达外源蛋白水平的重要因素之一,然而目的基因拷贝数对外源蛋白表达水平的影响,会因为外源蛋白特性的不同而不同,可能会有正的量效关系,也会有负的量效关系。因此在实际研究中,尚不能从理论层面上预测目的基因拷贝数对外源蛋白表达量的影响,而需要通过具体的试验工作来进行研究。

[1] 戊型肝炎病毒多拷贝重组质粒的构建及在毕赤酵母中的表达[J].

[2] 恶性疟原虫pfs25多拷贝基因在毕赤酵母中的表达分析[J].


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