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[交流] [外科综合] 人神经生长因子基因在酵母中的表达研究

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神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是一种由118个氨基组成的蛋白质,是神经科学领域中最引人注目的课题之一。但是由于NGF3个链内二硫键影响折叠的原因,用传统的基因工程方法获得大量rhNGF有相当的困难。研究发现,将hNGF蛋白在毕赤酵母表达系统中进行外泌表达,克服了rhNGF无天然活性的问题,表达产物分泌于胞外有利于下游的纯化。该研究为rhNGF规模生产和临床应用打下良好基础,也为同类产品的研发提供了技术平台,有利于其它难表达基因产品的制备开发。
毕赤酵母Pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统,广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面,目前已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。美迪西科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台,提供优质的重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。
目前NGF在临床上**于治疗周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、化学试剂或药物引起的神经中毒等神经系统疾病,疗效显著,是迄今唯一可能应用于临床治疗的神经系统蛋白质因子,而且在一些肿瘤中NGF及其受体常有高浓度表达。美国在应用基因工程的方法生产rhNGF方面已取得很大进展,可是他们在临床适应证的研究上颇费周折。最近,我国SDA批准了鼠源NGF上市,用于治疗化学中毒引起的神经疾病;但基因工程方法生产rhNGF还未取得突破。我国有研究者尝试了将人神经生长因子基因在酵母中的表达。
1、材料和方法
(1)菌株
通过全基因合成得到人神经生长因子(hNGF)的全基因片断,将该基因片段插入到含有AOX1启动子和分泌信号肽序列的载体pPIC9K中,构建了重组表达质粒pPIC9K/rhNGF,转化Pichia pastoris GS115宿主菌。
通过比较转化子在培养基MM和MD平板上的生长状况,筛选His+ Mut+表型转化子,并在2.0 mg/mL G418平板上筛选得到多拷贝转化子。摇瓶培养,甲醇诱导外源基因表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明重组蛋白质相对分子质量13.6×103,能与特异性抗体发生免疫反应;鸡胚背神经节法测rhNGF活性,结果显示表达活性可达104 U/mL。
(2)方法
蛋白表达条件的优化根据影响酵母表达的各种关键因素,设计了正交试验选择表达条件。 工程菌的发酵培养及蛋白表达取液氮保存甘油管菌株,取适量无菌操作涂布于YPD平板上,30℃条件下倒置培养活化24 h。取活化平板上3~5个单菌落,接于BMG摇瓶,30℃,200 r/min摇床培养24h。以0.5%比例转接入二级BMG培养基,30℃摇床200 r/min培养24 h,当菌密度达1.0~1.3时,以10%比例接于有BMG培养基的发酵罐中,30℃条件下发酵培养,溶氧(dissolved oxggen, DO)控制在30%,pH为6.0,期间流加甘油。甘油消耗完毕,菌密度达到200以上,DO急剧变化时,开始补加甲醇诱导表达,通过甲醇量控制DO在30%~40%,甲醇残余不超过1%,补充NH3H2O控制pH 5.6~5.8,诱导表达60h。
蛋白的纯化将发酵液在低温条件下离心,发酵上清超滤浓缩后,经C4-Sepharose疏水层析和CM-Sepharose层析纯化,即得rhNGF。
 2、结果  
(1)酵母表达正交试验结果
  根据实验结果,选择的较佳表达条件是:发酵温度28~30℃,甲醇诱导浓度为1.0%~0.8%,发酵pH 5.6~5.8,诱导表达60 h后收集发酵液上清。最高外泌表达活性可达104 U/mL。
(2) rhNGF的表达及活性测定结果
取甲醇诱导60h的发酵液,做SDS-PAGE和生物学活性检查。
  电泳结果表明,工程菌表达分泌rhNGF量约为每升发酵液50 mg,约占外泌蛋白的50%,活性测定结果表明,分泌蛋白的活性约为每毫升培养液104U。
(3)蛋白纯化结果
  电泳结果显示,该酵母表达系统表达的rhNGF,经疏水层析和阳离子交换层析纯化后,纯度可达到95%以上。2步纯化后的样品活性大于105U/mg。
(4)免疫印迹实验结果
  将纯化后的rhNGF进行Western blot杂交分析,结果与抗NGF抗体呈阳性反应。
由于天然的NGF来源少,不能满足临床和科学研究的需要,因此,利用基因重组技术来获得大量高活性的人NGF蛋白已成为当务之急。Pichia pastoris 酵母表达系统具有高表达率、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点,同时作为真核生物,它能使外源基因正确翻译和翻译后加工,其蛋白糖基化的方式接近高等生物,临床应用更为安全。试验表明,运用Pichia pastoris 酵母表达系统可以表达NGF蛋白,而且具有较高的表达率,也为进一步的蛋白提纯提供了方便条件。


评分记录
  • chenws   金币  +5   感谢您一直支持!   18-8-10 16:24


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感谢参与!


随着分子生物学技术的发展,利用微生物表达系统生产外源基因产物已经成为可能。酵母是单细胞低等真核生物,酵母表达系统与昆虫表达系统、哺乳动物表达系统相比,兼具两者优点,同时酵母表达系统具有操作简单,成本低廉,可大规模进行发酵等特点,因此是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。


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