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[交流] [先天性疾病] 浅析RPL30基因哺乳动物表达载体的构建及其与神经发育的关系

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核糖体蛋白RP基因是一个丰度较高、高度保守的基因家族,其中RPL30基因编码的RPL30蛋白参与真核生物核糖体60S大亚基的组成,与细胞正常生长和生存密切相关。克隆RPL30基因并构建其哺乳动物表达载体,可以为RPL30基因与疾病的关系及其下一步研究打下基础。通过SSS筛选金黄色地鼠神经管cDNA文库,获得RPL30cDNA全长序列,制备cDNA探针,发现RPL30基因与神经管的形成及分化密切相关。
临床前CRO公司美迪西生物医药所提供的哺乳动物蛋白表达系统基于无血清培养体系提供基因表达优化、瞬时表达及抗体生产等多种真核蛋白服务项目。其科研人员建立了成熟的哺乳动物蛋白表达系统及纯化服务平台,提供哺乳动物蛋白表达系统的表达与纯化服务。
1、RPL30基因的克隆及其哺乳动物表达载体的构建
应用RT-PCR方法扩增出目的基因的全长编码区,并利用双酶切连接法将其连入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)。采用脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2细胞后应用RT-PCR法检测RPL30基因的表达以及其超表达对硒蛋白P基因转录水平的影响。同时在转染细胞中添加无机硒后研究其对RPL30和硒蛋白P基因转录水平的调控。
结果成功地构建了RPL30表达质粒pcDNA3.1-RPL30,转染HepG2细胞后实现基因的超表达,相对于GFP对照转染细胞增加了4~5倍。然而,RPL30基因的超表达并没有显著提高硒蛋白P的转录水平。硒对RPL30基因的表达基本上没有影响,但却显著提高硒蛋白P的表达水平。RPL30哺乳动物表达载体的成功构建以及RPL30超表达后的初步分析为下一步深入研究硒蛋白的生物合成机制打下了基础。
2、RPL30基因与神经管发育的关系
神经管发育是胚泡中一部分细胞在外源信号和内部基因调控网络的精密调控下逐步进行命运决定的过程。神经诱导是神经管发育中最早的一个关键事件,它是一部分上胚层细胞特化形成神经外胚层细胞的过程。神经外胚层紧接着会分化形成脑部不同区域的神经前体细胞,最终形成大脑和脊髓。因此,神经诱导缺陷会导致非常严重的神经管畸形。每年全世界有超过30万新生儿患有神经管畸形,这些患病儿在出生前后死亡的概率很大。即使幸存的新生儿也会面临终身的身心障碍,包括一些神经病学、认知、行动、泌尿或胃肠系统的并发症。研究表明RPL30基因可能与神经管发育密切相关。
通过构建金黄地鼠神经管cDNA文库,筛选了RPL30基因,并探讨了其与神经管发育的关系。提取胚胎(E)8.5 d的金黄地鼠神经管总RNA,用SMART技术构建神经管cDNA的噬菌体表达文库。利用分部分排除技术(SSS法),结合PCR法逐级筛选cDNA文库。将得到的RPL30阳性噬菌斑进行质粒转化、酶切鉴定及测序分析,进而回收、纯化RPL30 cDNA片段并制备探针。用Northern杂交技术检测神经管发育过程中RPL30 mRNA的表达状况。
结果显示,构建的神经管cDNA文库容量为1.5×106 pfu/ml,重组率达到99%,平均插入片段长度大于1 kb。经过筛选得到含RPL30 cDNA的阳性克隆,序列测定及同源性分析发现,该cDNA片段全长535 bp,其中含有完整的开放阅读框。Northern杂交结果显示,在E8 d~E12 d各时间段,神经管中RPL30 mRNA的表达均处于较高水平,且随着时间的增长,表达量递增,于E12 d达到高峰。本文结果表明采用SSS技术结合PCR法从神经管cDNA文库中克隆到了RPL30基因的全长cDNA序列,该基因可能与神经管发育密切相关。
哺乳动物表达系统具有通过哺乳细胞翻译后,加工修饰产生的外源蛋白质在活性方面远远高于原核表达、昆虫细胞表达系统及酵母表达系统等真核表达系统。晶型RPL30基因的克隆及其哺乳动物表达载体的构建,然后将该基因导入到人肝癌细胞系HepG2进行初步表达,从而考察了RPL30的超表达对硒蛋白P转录水平的影响。


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  • chenws   金币  +5   感谢参与!   18-11-4 17:20


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