Trizol 法提取总RNA

总RNA 抽提试剂盒（Trizol 法）
GK 3001 25 次
GK 3002 50 次
一. Trizol 试剂组成
Catolog No. GK3001 GK3002
Trizol 25ml 50ml
异丙醇 13ml 25ml
DEPC-H2O 1ml 2ml
75%乙醇 40ml 80ml
注意：Trizol 是强腐蚀性物质，小心存放于4℃!!
用户需要自行准备氯仿。
二、产品简介
研究基因表达、调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA，RNA 质量的高低直接决定RT-PCR、cDNA 文
库构建、Northern Blot 等分子生物学实验的成败。Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物
质，能迅速破碎细胞，释放细胞RNA，同时抑制细胞释放的核酸酶。Trizol 适用于从各种组织或细胞中快速纯
化总RNA。
三、实验准备
1. RNA 酶(RNase)是导致RNA 降解最主要因素，其自身非常稳定，仅在一些极端的条件可暂时失活，但限制
因素去除后又迅速恢复活性。常规的高温高压蒸汽灭菌法、蛋白酶抑制剂不能有效抑制RNase 活性。
RNase 广泛存在于人的皮肤表面，因此制备RNA 时必须戴手套、戴口罩。
2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC 配
制的75%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a) 塑料制品：尽可能使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常
不必再处理。对于国产塑料制品，原则上处理后方可使用。处理方法如下：
①在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC 使其终浓度为0.05% (后文中记作DEPC-H2O)。
注意：DEPC 为活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。
②将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到
溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。
将DEPC-H2O 小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸
汽灭菌至少30min。
④灭菌塑料制品在合适的温度(80-90℃)下烘烤干燥。置洁净处备用。
(b) 玻璃和金属物品250℃烘烤3 小时以上。
各种样品的最大使用量（1ml Trizol）：

四、操作步骤
1.在液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5-ml 离心管中。细胞经计数后直接加
入离心管，然后5,000 rpm 室温离心去上清。每100 mg 组织或5x106 个细胞加1.0ml 的 Trizol。注意：如果
组织量（1-10 mg）或细胞数很少（102-104），在样品中加入800μl 的Trizol，用枪头反复抽吸混匀，再加
入糖原(终浓度为250μg/ml)，剧烈振荡或用匀浆器匀浆。
2.用1ml 针筒，26-G 号（6#）针头抽吸匀浆液15～20 次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到
无菌1.5-ml 离心管中。
3.加入200μl 氯仿/异戊醇(24∶1)或氯仿，剧烈振荡混匀30s。
4.台式离心机上，12,000 rpm，室温离心5min。
5.将上清液小心转移到RNase-free 1.5-ml 离心管里，加入等体积的异丙醇，室温下放置5min。(注意：不要
吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA 污染。)
6.台式离心机上，12,000 rpm，室温离心5min。
7.小心移去上清液，防止RNA 沉淀丢失。
8.用75% 酒精洗涤两次，每次700μl，12,000 rpm，室温离心2min。
9.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA 沉淀丢失。
10.真空离心干燥3～5min，或放在室温下使酒精完全挥发。
11.沉淀用30～50 μl DEPC-H2O 溶解。如发现沉淀难溶，68℃温育10min。对于胰腺,肾等组织中RNase 含量
很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解。
12.RNA 的分析和定量：
(1) 测定样品在260nm 和280 nm 的吸收值确定RNA 的质量。按1 OD=40μg RNA 计算RNA 的产率: OD260/280 在
1.9-2.0 视为抽提的RNA 的纯度很高。若需精确量化，只有浓度在4μg/ml 以上的样品适于用光度计测定。
(2) 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA 的完整性和污染情况。
注意：很少量的样品中加入糖原以提高RNA 的产率。糖原(<4mg/ml)的存在，不影响cDNA 第一链的合成，也
不影响PCR。
五．问答
使用本试剂对不同组织材料提取的RNA 量有何不同？
样品类型 最大使用量
动物细胞 1x107
细 菌 1x109
酵 母 1x107
动物组织 50mg
植物组织 100mg
丝状真菌 100mg
一般情况下每毫克的组织或1×106 个细胞中所能提取的RNA 量如下表
通过在不同波长下的吸光度，如何评价RNA 质量?
有关RNA 的吸光度说明如下：
260nm、320nm、230nm、280nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光
度值。 OD260/OD280（R）体现了RNA 中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA 的R 值应在1.8～2.0 之
间，当R<1.8 时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R> 2.2 时，说明RNA 已经被水解成了单核苷酸。
在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。
如何计算RNA 的浓度?
RNA 浓度 =（OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 　g/　l。
提取的RNA 中含有多糖怎么办?
大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA 十分接近，因此很难将其从RNA 中除去，使
用此类组织材料提取RNA 时，建议增加TRIzol Reagent 的使用量。
RNA 提取量较低怎么办?
① 向组织材料中加入RNAiso Reagent 后，请充分研磨匀浆使其充
分裂解。
② 相分离后请尽量完全回收上清液。
提取的RNA 不溶怎么办?
① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。
② 可以于60℃加热5 分钟后再于冰上溶解数小时。
③ RNA 沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸
取上清液时，不要让枪头接触蛋白层。
④ 溶解液更换为0.5%的SDS 溶液（DEPC 处理水配制)。
OD260/OD280 值<1.65，为什么?
① RNA 应使用TE Buffer 稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强
度或低pH 值会使OD280 值升高。
② 样品裂解时加入的RNAiso Reagent 量偏少，造成蛋白变性不充
分，可以再次对RNA 溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。
③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间
不足5 分钟。
④ 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
⑤ RNA 未充分溶解。
提取的RNA 降解，为什么?
① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA 的组织材料应采用新鲜的
组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
② 提取RNA 时使用的试剂及器材中有RNA 分解酶污染。
③ 提取的组织材料中含有大量的RNA 分解酶，而RNAiso Reagent
的添加量不够。
提取的RNA 中含有DNA 污染，为什么?
① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent 量偏少。
② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、
高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
③ 如果提取的RNA 中含有DNA 时，可以使用DNase I 进行DNA 消化